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Studie: Risk Assessment of Antibiotic Resistance Marker Genes in Genetically Modified Organisms

Die im Auftrag des BMGFJ (nun BMG) verfasste Studie mit dem Titel "Risk Assessment of Antibiotic Resistance Marker Genes in Genetically Modified Organisms" ist von Mag. Markus Wögerbauer (Medizinische Universität Wien) erstellt worden und erschien im Jahr 2007.

Zusammenfassung:

Antibiotika-Resistenzmarkergene aus gentechnisch veränderten Organismen (GVO) inaktivieren Antibiotikapräparate, die klinisch oder veterinärmedizinisch eingesetzt werden. Die massive Freisetzung derartiger Antibiotika-Resistenzmarkergene über den kommerziellen Anbau von transgenen Pflanzen oder über die Verbreitung von gentechnisch modifizierten Organismen in Freilandversuchen könnte ein Ansteigen von Antibiotika resistenten Bakterien verursachen, die den Therapieerfolg bei Infektionskrankheiten gefährden.

Dieses Gefahrenpotential wurde von den Verantwortlichen im Europaparlament und der Europäischen Kommission erkannt und im Rahmen der Richtlinie 2001/18/EG einer Regelung unterworfen. Diese Reglementierung fordert den schrittweisen Ausstieg aus der Antibiotika-Resistenzmarkergen-Technologie für kommerziell verwertete GVO, die schädliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit oder die Umwelt haben könnte, bis zum Ende des Jahres 2004 (im Falle von gemäß Teil C in den Verkehr gebrachten GVO bis zum 31. Dezember 2004; Art. 4 (2) RL 2001/18/EU) und für genetisch veränderte Organismen in Freilandversuchen bis 2008 (im Falle von gemäß Teil B zugelassenen GVO für Freisetzungsexperimente bis zum 31. Dezember 2008). Sinnhaftigkeit und Notwendigkeit dieses Schrittes werden seitdem unter Experten heftig diskutiert.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Evaluation dieses von Antibiotika-Resistenzmarkergenen ausgehenden Risikos unter Berücksichtigung der mit Stand August 2007 zur Verfügung stehenden Fachliteratur.

Folgende Punkte wurden bei der Risikobewertung von ARM Genen in Betracht gezogen:

  1. Darstellung der biochemischen und genetischen Charakteristika der am häufigsten verwendeten Antibiotika-Resistenzmarkergene (nptII, blaTEM-1, hph, aadA, nptIII, cat, tetA) und der zugehörigen Proteine.
  2. Abschätzung der Hintergrundbelastung mit Antibiotika-Resistenzmarkergen ähnlichen Resistenzen in den natürlichen Lebensräumen von Bakterien.
  3. Abschätzung der klinischen Bedeutung der durch ARM Gene inaktivierten Antibiotikapräparate.
  4. Abschätzung der Transferhäufigkeit von Antibiotika-Resistenzmarkergenen von transgenen Pflanzen auf Bakterien unter natürlichen Umgebungsbedingungen. Der Analyseschwerpunkt liegt auf der Darstellung der Stabilität von freier DNA im natürlichen Habitat, der Beschreibung der auftretenden Selektionskräfte und der Effizienz der Übertragung und Integration von fremdem genetischen Material ins bakterielle Genom.
  5. Darstellung von Ersatzmethoden, mit deren Hilfe auf den Einsatz von Antibiotika-Resistenzmarkergenen verzichtet werden kann. Vorteile, Zugang zur Technologie und Kosteneffizienz im Vergleich zum etablierten und am meisten genutzten nptII-System werden diskutiert.

Der massive und unkritische Einsatz von Antibiotikapräparaten in der Therapie von Infektionskrankheiten und in der Tierzucht hat wesentlich zum Aufbau eines riesigen Pools an Resistenzgenen in natürlich vorkommenden Bakterienpopulationen beigetragen. Das Auftauchen von multi-resistenten Bakterienstämmen führt zu schwersten Problemen bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, was sich auch in einem deutlichen Anstieg der Morbidität und Mortalität und einer dadurch immens steigenden Belastung des öffentlichen Gesundheitswesens ablesen lässt.

Antibiotikaresistente Bakterien entstehen entweder durch spontane Mutationen oder durch die Akquisition von intakten Resistenzgenen mittels horizontalen Gentransfers. Unser gegenwärtiges Verständnis über die Resistenzentwicklung ist eher beschreibender als vorhersagender Natur. Obwohl inzwischen relativ klar die Aufnahme neuer Resistenzdeterminanten sowohl auf molekularer und organismischer als auch auf geographischer Ebene dargestellt werden kann, bleibt der initiale Transfervorgang – der Ursprung der Resistenzdeterminante bzw. der primäre Resistenzgen-Donor meist im Dunklen. Ebenso sind jene Umgebungsbedingungen, die das Wachstum der ersten Generation resistenter Bakterien begünstigen, häufig noch völlig unbekannt. Aber ohne diese Informationen und ein klares Verständnis der wirkenden Selektionskräfte in bakteriellen Populationen ist es unmöglich, genau jenen Effekt vorherzusagen, den eine vermehrte künstliche Einbringung von Resistenzgenen via transgene Organismen hervorrufen wird.

Das EFSA GMO Panel hat 2004 diese Wissenslücken erkannt und versucht, über die Aufstellung von drei Kriterien diesen Mangel an Vorhersagekapazität über die Auswirkungen von Antibiotika-Resistenzmarkergenen im natürlichen Habitat zu kompensieren.

Diese Kriterien sind:

  1. Charakterisierung des gegenwärtig in der Natur vorkommenden Pools an Resistenzdeterminanten, die den ARM Genen entsprechen.
  2. Identifizierung der Selektionsbedingungen, die das Wachstum von Bakterien begünstigen, die ARM Gene aufgenommen haben.
  3. Charakterisierung der klinischen Bedeutung der durch ARM Gene inaktivierten Antibiotikapräparate.

Die Analyse des ersten Kriteriums erlaubt eine vergleichende Abschätzung des relativen Anteils der jeweiligen ARM Gene aus GVO am gesamten Resistenzgenpool in der Umwelt. Das zweite Kriterium gibt Auskunft über die notwendigen Rahmenbedingungen, die eine positive Selektion von Bakterien, die ARM Gene aufgenommen haben, ermöglichen, um zu klinisch gefährlichen Pathogenen heranwachsen zu können. Die Einbeziehung des dritten Kriteriums ermöglicht eine Kategorisierung der am häufigsten eingesetzten ARM Gene in 3 Risikogruppen:

  • Gruppe 1: Kanamycin-Resistenz (nptII), Hygromycin-Resistenz (hph)
  • Gruppe 2: Ampicillin-Resistenz (blaTEM-1), Chloramphenicol-Resistenz (cat), Streptomycin-Resistenz (aadA)
  • Gruppe 3: Kanamycin-Resistenz (nptIII), Tetracyclin-Resistenz (tetA)

Der Einsatz von Gruppe 1 ARM Genen in transgenen Organismen wird vom EFSA GMO Panel als risikolos betrachtet. Bei Gruppe 2 ARM Gene können minimale negative human- und veterinärmedizinische Auswirkungen entstehen. Sie sollten nur in transgenen Pflanzen für bewilligte Freisetzungsexperimente zum Einsatz kommen, nicht aber in Pflanzen, die für eine kommerzielle Vermarktung vorgesehen sind.
Vertreter der Gruppe III sollten in transgenen Pflanzen vermieden werden, da diese Antibiotika-Resistenzmarkergene humantherapeutisch wichtige Antibiotika inaktivieren.

Obwohl das EFSA GMO Panel einen wertvollen Beitrag zur grundlegenden Risikoklassifizierung von ARM Genen geleistet hat und die Arbeit vor allem durch die Menge an gesammelten Daten beeindruckt, sind in der Zwischenzeit einige gravierende Mängel bei der Sammlung und Interpretation der Daten aufgetaucht, die die Risikoklassifizierung überprüfenswert erscheinen lassen:

  1. Es ist nicht klar, was das EFSA GMO Panel unter Häufigkeit von Resistenzgenen versteht, wie das Vorkommen dieser Gene mengenmäßig erfasst wird, und in welcher Relation das Ergebnis der Häufigkeitsanalyse zur Gruppen-Klassifizierung steht. Es ist unklar, ob sich das Häufigkeitsargument nur auf die Kopienzahl des jeweiligen ARM Genes bezieht oder ob die relative Häufigkeit von ARM Gen Homologen in klinisch relevanten Bakterienisolaten (womöglich aus verschiedenen Ländern) ebenfalls bedacht wird. Der Mangel an experimentell ermittelten Daten und das Fehlen von eindeutigen quantitativen Definitionen führt rasch zu subjektiven und angreifbaren Interpretationen bei der Auslegung der relevanten Antibiotikaverbrauchsmengen und Hintergrundresistenzbelastungen bei der Zuordnung zu den jeweiligen Risikogruppen (siehe Norwegian Scientific Panel on Genetically Modified Organisms and the Panel of Biohazards).
  2. Das EFSA GMO Panel geht im wesentlichen und undifferenziert von einer hohen Hintergrundbelastung mit Resistenzdeterminanten in natürlich vorkommenden Bakterienpopulationen aus. Dieser Standpunkt vermittelt den Eindruck, dass die zusätzliche Einbringung von Resistenzfunktionen via ARM Gene in den natürlichen Resistenzgenpool ohne wesentliche Auswirkungen bleibt. Aber die Annahme einer hohen Hintergrundbelastung mit Resistenzgenen zieht weder stamm- oder speziesspezifische Unterschiede in den Resistenzraten in Betracht, noch beachtet sie völlig unterschiedliche Resistenzraten bei ein und der selben Spezies in unterschiedlichen Ländern. Die tatsächlich vorkommenden Resistenzraten wurden am Beispiel Kanamycin/Neomycin (nptII) und Penicillin (blaTEM-1) Resistenz europaweit ermittelt. Für beide Resistenzdeterminanten konnte gezeigt werden, dass sie in zahlreichen Habitaten und bei mehreren Referenzstämmen äußerst selten auftauchen und somit ganz im Gegensatz zur vom EFSA GMO Panel propagierten Ansicht unter gewissen Umständen eine äußerst niedrige Hintergrundbelastung aufweisen.
  3. Das EFSA GMO Panel ignoriert im wesentlichen substantiell unterschiedliche länderspezifische Anwendungs- und Verbrauchmuster von Antibiotikapräparaten und hebelt dadurch Kriterium 2 aus, da so die im natürlichen Habitat herrschenden Selektionsdrücke nicht richtig eingeschätzt werden können. Das EFSA GMO Panel ignoriert den dynamischen Charakter der Hintergrundbelastung mit Resistenzgenen, da diese Resistenzfunktionen via horizontalen Gentransfer leicht ausgetauscht werden und sich Bakterienpopulationen so rasch an sich verändernde Umweltbedingungen anpassen können. Dies beinhaltet auch einen eventuellen Rückgang der entsprechenden Resistenzraten. Der aktuelle Antibiotika-Verbrauch in Europa wird anhand von Penicillin dargestellt und in Relation zur Resistenzsituation von S. pneumoniae gebracht.
  4. Ein wichtiger Eckpfeiler der EFSA GMO Panel Argumentationslinie zur Risikoklassifizierung der Gruppe 1 und 2 ARM Gene ist die Behauptung, dass die korrespondierenden Antibiotika klinisch nicht mehr relevant seien. Diese Annahme ignoriert wieder länderspezifische Eigenheiten beim Antibiotikaverbrauch. Einige europäische Staaten setzen beispielsweise eine Substanz in hohen Mengen ein – dieselbe Substanz wird aber im Extremfall in einem anderen Mitgliedsland vielleicht gar nicht mehr im Handel vertrieben. Folgende Beispiele sollen repräsentativ die Situation darstellen: In Estland wurde erst kürzlich Kanamycin in den nationalen Tuberkulose Therapieplan aufgenommen. In Österreich ist im Gegensatz dazu dieses Antibiotikum für humantherapeutische Anwendungen am Markt nicht einmal erhältlich. In Schweden wurden im Jahr 2004 10 g Neomycin humantherapeutisch und 30 kg in der Landwirtschaft und Viehzucht eingesetzt. Im Gegensatz dazu werden in Holland mehr als 30 000 kg Kanamycin und Neomycin jährlich im Veterinärbereich eingesetzt. Französische Ärzte verabreichten ihren Mitbürgern ca. 19 dd (tägliche Dosis umgerechnet auf 1000 Einwohner pro Jahr) Penicilline im Jahr 2001, wohingegen man in Holland im selben Vergleichszeitraum mit nur 3,5 dd das Auskommen fand.
  5. Laut EFSA GMO Panel ist eine niedrige Transferhäufigkeit von ARM Genen in natürlichen Habitaten gleichzusetzen mit einem niedrigen Risiko für negative Auswirkungen auf Gesundheit und Umwelt. Diese Ansicht ist nicht richtig, da Transferfrequenzen wenig prädiktive Aussagekraft über Langzeitfolgen von sporadisch vorkommenden Gentransfervorgängen haben. Dieser Umstand ist gegenständlich besonders prekär, da es berechtigte Zweifel gibt, ob mit den zurzeit zur Verfügung stehenden Mitteln und Methoden diese seltenen – aber sehr wohl relevanten - Transfervorgänge überhaupt erfasst werden können. Überdies kann eine einzige erfolgreiche ARM Gen Übertragung ausreichen, um einen in weiterer Folge resistenten Stamm zu bilden.
  6. Das EFSA GMO Panel vermeidet die quantitative Erfassung von resistenten Stämmen in potentiellen Rezeptorpopulationen (=Hintergrundbelastung mit Resistenzen) und bezieht auch keine quantitativen Angaben der potentiell über GMOs eingebrachten ARM Gene (=Kopienanzahl) in die Diskussion mit ein. Ein quantitatives Verständnis dieses Phänomens ist jedoch unabdingbar, um die Auswirkungen zusätzlich eingebrachter ARM Gene tatsächlich ernsthaft abschätzen zu können.
  7. Das EFSA GMO Panel geht davon aus, dass in natürlichen Habitaten (Felder, Boden etc.) kein oder kaum ausreichend großer Selektionsdruck herrscht, um raren ARM Gen Transformanten einen Wachstumsvorteil zu ermöglichen, der ihnen erlaubt, einen relevanten Anteil in der Bakterienpopulation einzunehmen. Jüngste Daten deuten jedoch darauf hin, dass gerade im Ackerboden, auf und in Pflanzen bedeutende Mengen an Antibiotika anzutreffen sind, die auch über längere Zeit persistieren und durchaus in der Lage sind, positiven Selektionsdruck auszuüben. Die Anwendung von Antibiotika im veterinärmedizinischen Bereich erzeugt ebenfalls beachtlichen Stress in Bakterienpopulationen.

Die Stellungnahme des EFSA GMO Panels entspricht daher nicht notwendigerweise der vorsichtigeren Vorgangsweise bezüglich ARM Genen in kommerziell verwertbaren transgenen Pflanzen in Österreich.

In Übereinstimmung mit der "ad hoc group of the Norwegian Scientific Panel on Genetically Modified Organisms" und dem "Panel of Biohazards" konnten im vorliegenden Report deutlich unterschiedliche länder-spezifische Einsatz- und Verbrauchsmuster bei Antibiotikapräparaten sowie signifikant unterschiedliche Hintergrundresistenzraten dokumentiert werden. Diese Beobachtungen unterstreichen die Bedeutung und die Notwendigkeit einer "case-by-case" Risikoanalyse eines jeden GMO Freisetzungs- oder Vermarktungsantrags, bei der länderspezifische Besonderheiten berücksichtigt werden müssen. Die massive großflächige Einbringung von ARM Genen mittels transgenen Nutzpflanzen in ein Gebiet mit niedriger intrinsischer Resistenz wird bei der Risikoanalyse zwangsläufig zu einem anderen Ergebnis führen im Gegensatz zu Habitaten mit hohen Background-Resistenzraten. Diese Überlegung gilt auch für das Gruppe 1 ARM Gen nptII.

Die allgemein behauptete, hohe Rate an bereits vorhandenen Resistenzen im bakteriellen Genpool lässt sich zumindest anhand der Resistenzprofile von klinisch relevanten Pathogenen nicht schlüssig nachvollziehen. Es treten gegenwärtig substantielle länderspezifische Unterschiede in der Resistenzlage bei ein- und demselben Krankheitserreger auf. Als plakativstes Beispiel sei hier die Penicillin-Resistenz von Streptococcus pneumoniae dokumentiert: Die Resistenzraten differieren in Europa sogar zwischen Nachbarstaaten zwischen 1-5% (Deutschland) und 50% (Frankreich, Spanien). Die Einbringung von Ampicillin-Resistenzen aus transgenen Pflanzen trifft somit in Deutschland auf einen völlig anderen Resistenzlage-Hintergrund als in Frankreich, was logischerweise zu einem veränderten, länderspezifisch angepassten Risikoprofil führen müsste. Eine analoge Situation ergibt sich bei der Betrachtung von Penicillin-Resistenzen bei unterschiedlichen Bakterienspezies: während Enterokokken und Pneumokokken niedrige Raten (< 2%) zeigen, erreicht die Ampicillin-Resistenz bei E. coli fast 50%, bei Staphylococcus aureus liegt sie bei nahezu 80%. Eine ähnliche Situation ist bei Bakterienisolaten aus Umweltproben (Boden, Vogeldarm, Eber, Schweine, Rinder, Geflügel etc.) bezüglich Aminoglykosid Resistenz zu beobachten. Es ist daher nicht statthaft, undifferenziert von einer gleichmäßig hohen Hintergrund-Belastung mit Resistenzen auszugehen.

Am Beispiel der in Österreich und Deutschland aktuellen Antibiotikatherapien kann gezeigt werden, dass die durch Antibiotika-Resistenzmarkergene inaktivierten Antibiotika (mit Ausnahme von Aminoglykosiden) durchaus eine zentrale humantherapeutische Rolle spielen. Es kann nicht undifferenziert davon ausgegangen werden, dass es sich bei den durch Gruppe 1 und 2 ARM Genen inaktivierten Antibiotika-Präparaten um klinisch irrelevante Substanzen handelt. Ampicillin, Amoxicillin und Penicillin G sind in vielen Fällen noch immer Antibiotika der ersten Wahl und somit unverzichtbar in der täglichen klinischen Praxis. Sogar Neomycin, Paromomycin und Streptomycin werden in seltenen Fällen bei terminal erkrankten Patienten oder für die Behandlung von exotischen Infektionen eingesetzt. Chloramphenicol ist in Entwicklungsländern Antibiotikum der ersten Wahl bei zahlreichen Indikationsstellungen. Hygromycin hat keine humantherapeutische Bedeutung.

Das nptII Gen, das bevorzugt Neomycin, Kanamycin und Paromomycin inaktiviert, wurde als Gruppe 1 ARM Gen eingestuft. Durch Fehler in der Dateninterpretation (siehe oben) und neue verfügbare Informationen kann man davon ausgehen, dass diese Klassifizierung nicht für alle europäischen Staaten in gleicher Weise gültig sein kann: Neomycin wurde kürzlich von einer WHO Arbeitsgruppe als "critically important antibiotic" eingestuft. Die EMEA hat in Übereinstimmung mit dem EFSA GMO Panel bekräftigt, dass Neomycin zur Behandlung schwerer Erkrankungen wie zum Beispiel hepatischer Enzephalopathie eingesetzt wird. Aufgrund des vermehrten Auftauchens multiresistenter Stämme (z. B. Mycobacterium tuberculosis) werden Aminoglykoside als Behandlungsalternative immer wichtiger. Kanamycin wird in den Vereinigten Staaten und Estland bei der Behandlung von multiresistenter Tuberkulose empfohlen und ist auf der Liste der potentiell einzusetzenden Mittel im Falle eines bioterroristischen Angriffs. Als interessante Langzeitperspektive kann die Entwicklung von Neomycin- oder Kanamycin-Derivaten betrachtet werden, die eine geringere Toxizität als die Ausgangssubstanzen aufweisen. Die dadurch entstehenden neuen therapeutischen Optionen könnten durch nptII bedroht werden. In der Veterinärmedizin sind Aminoglykoside von zentraler Bedeutung. Gerade Neomycin, Kanamycin und Paromomycin sind für die Behandlung von Infektionen in Lebensmittel produzierenden Tieren lizenziert. Die EMEA schlussfolgert, dass Neomycin und Kanamycin für human- und veterinärmedizinische Anwendungen von Bedeutung sind und ihr gegenwärtiger oder potentieller zukünftiger Einsatz eine Klassifikation von keiner oder vernachlässigbarer Relevanz NICHT zulässt.

Obwohl das Risiko von negativen Effekten auf Gesundheit und Umwelt aufgrund einer Freisetzung von nptII als relativ gering eingestuft werden kann, sollten Länder mit einer niedrigen Aminoglykosid-Resistenzrate doch Vorsicht walten lassen. Eine massive Verbreitung von nptII über gentechnisch veränderte Organismen wird sicher zu einer Verschiebung der Expositionsorte und der Expositionsraten bei Boden- und Darmbakterien führen, die den Mikroorganismen bis dato nicht zur Verfügung gestanden sind. Da relativ wenig überzeugende quantitative Daten bezüglich der Prävalenz des nptII Gens in natürlichen Habitaten zur Verfügung stehen, kann keine Empfehlung für Freisetzungsexperimente abgegeben werden. Zeitliche und örtliche Limitierungen bei Freisetzungsexperimenten könnten sehr wohl zu einer weiteren Reduzierung der Gentransferrate zwischen GMO und Bakterien führen. Im Gegensatz dazu ist die Situation mit gentechnisch veränderten Futtermittelpflanzen zu sehen, die zu einer Exposition bakterieller Populationen über Jahre und weite Flächen hinweg führen.

Über Hygromycin-Resistenzraten ist relativ wenig bekannt, trotzdem dürfte die Klassifizierung als Gruppe 1 ARM Gene vernünftig sein, da Hygromycin keine Bedeutung in der Humanmedizin hat und nur beschränkt in der Tierzucht verwendet wird.

Besondere Vorsicht ist beim Einsatz von blaTEM-1 als ARM Gen in transgenen Organismen für kommerzielle Zwecke und für Feldversuche in Ländern mit niedriger Penicillin Hintergrundresistenzrate zu empfehlen. Es sollte eigentlich eine Sache des Hausverstands sein, freiwillig den künstlichen Eintrag von Penicillin-Resistenzen via ARM Gene auf ein Minimum zu reduzieren. Ganz besonders dann, wenn man die klinische Bedeutung der inaktivierten Antibiotika in Betracht zieht. Hier sollte auch auf den Einsatz von zur Verfügung stehenden Alternativen zur ARM Gen Technologie hingewiesen werden.

In Österreich haben Chloramphenicol und Streptomycin eine geringe Anzahl an Indikationsstellungen. Obwohl beide Präparate selten angewendet werden, werden sie letztlich bei lebensbedrohlichen Infektionen ohne andere Behandlungsalternative eingesetzt. Die therapeutische Signifikanz ist daher für Spezialfälle gegeben. Die Hintergrundresistenzraten variieren ähnlich wie bei den gezeigten Beispielen mit blaTEM-1 und nptII. Die Zustimmung für Freisetzungen bei Feldexperimenten sollte von länderspezifisch ermittelten Resistenzraten und der jeweiligen lokalen therapeutischen Bedeutung der Präparate abhängen.

Die Einstufung von nptIII und tetA als Gruppe 3 ARM Gene wird für richtig befunden und vollinhaltlich unterstützt.

Es wird empfohlen, die ARM Gen Klassifizierung durch das EFSA GMO Panel als Grundlage und Ausgangspunkt zu akzeptieren. Trotzdem sollte es im Verantwortungsbereich der jeweiligen Behörde liegen, das Risiko länderspezifisch in einem case-by-case Verfahren jeweils neu abzuschätzen. Zu groß sind gegenwärtig noch die Unsicherheiten und Wissenslücken, der Mangel an repräsentativen quantitativen Daten und die lokalen Unterschiede bei Resistenzraten und Antibiotikaverbrauch. Dieser Ansatz beinhaltet natürlich auch die Möglichkeit für die Behörde zu einer Reklassifizierung der entsprechenden ARM Gene. Hilfreich könnte in diesem Zusammenhang die Einigung auf gewisse Indikator-Bakterienstämme sein, die europaweit für das Monitoring von ARM Gen spezifischen Resistenzen herangezogen werden. Die Entscheidung über die Bewilligung muss jedoch in jedem Fall auf wissenschaftlich gesammelten nationalen Daten beruhen und überprüfbar sein.

(19.12.2007)

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